کشت سلول‌های اندوتلیال قرنیه انسانی در محیط آزمایشگاه با استفاده از مایع آمنیوتیک انسانی

هدف: ارزیابی اثر مایع آمنیوتیک انسانی (Human Amniotic Fluid; HAF) بر روی رشد سلول‌های اندوتلیال قرنیه انسانی (Human Corneal Endothelial Cells; HCECS) و هم‌چنین تعریف محیط کشت برای رشد این سلول‌ها. روش پژوهش: سلول‌های آندوتلیوم در محیط 12DMEM-F که با سرم جنین گاوی 20 درصد غنی شده بود کشت داده شدند. پس از اشباع محیط کشت، سلول‌ها مورد درمان با تریپسین قرار گرفته و به محیط کشت حاوی سرم جنین گاوی 20 درصد و مایع آمنیوتیک انسانی 10، 20 و 30 درصد منتقل شدند. HAF از زنان باردار در سه ماهه اول بارداری گرفته شد. جهت ارزیابی اثر HAF بر روی رشد و توانایی زیستی سلول، از روش ELISA برای بررسی تکثیر و مرگ سلولی استفاده شد. ماهیت سلول‌های کشت داده شده در محیط حاوی مایع آمنیوتیک 20 درصد با استفاده از روش‌های ایمونوسیتوشیمی و Real time PCR جهت نشانگرهای ویژه HCECs شامل 67Ki-، Vimentin، Na/K-ATPase، و 1ZO- بررسی شد. یافته‌ها: کشت‌های اولیه در محیط حاوی مایع آمنیوتیک منجر به رشد و تکثیر سلول‌های آندوتلیوم در 8/95 درصد موارد گردید. Real time PCR و ایمونوسیتوشیمی نشان داد که نشانگرهای Na/K-ATPase و 1ZO- که ویژه HCECs می‌باشند در سلول‌های کشت شده در محیط حاوی مایع آمنیوتیک 20 درصد، بیش‌تر از محیط شاهد (حاوی سرم جنین گاوی) بیان می‌شود. آزمایش ایمونوسیتوشیمی روی سلول‌‌های اندوتلیال کشت داده شده با HAF 20 درصد، افزایش بیش‌تری را در بیان نشانگرهای مذکور در مقایسه با محیط‌های حاوی غلظت‌های 10 درصد و 30 درصد HAF نشان داد. تعداد سلول‌های اندوتلیال کشت داده شده در HAF 20 درصد که نشانگرها را بروز می‌دادند برای شاخص‌های Vimentin ،1-ZO ، Na/K-ATPase به ترتیب 98 درصد، 95 درصد، و 100 درصد بود. بیش از 80 درصد سلول‌ها، 67-Ki را بروز می‌دادند که نشان می‌دهد سلول‌ها ظرفیت تکثیر خود را حفظ کرده‌اند. میزان افزایش شاخص‌های Vimentin ،1-ZO ،Na/K-ATPase به ترتیب 5 برابر (003/0P=)، 5/3 برابر (001/0P=) و 3 برابر (03/0P=) در محیط حاوی HAF 20 درصد در مقایسه با محیط شاهد بود. Real time PCR افزایش 400 برابری (008/0P=) در بیان ژن Na/K-ATPase و افزایش 500 برابری (01/0P=) در بیان ژن 1-ZO در محیط حاوی HAF 20 درصد در مقایسه با محیط شاهد نشان داد. نتیجه‌گیری: محیط حاوی HAF 20 درصد به طور مشخصی باعث افزایش توانایی تکثیر سلول‌های آندوتلیال قرنیه انسان می‌شود ولی مشخصات مورفولوژی و آنتی‌ژنیک آن‌ها را حفظ می‌نماید. بنابراین HAF می‌تواند به عنوان یک مکمل غنی در مطالعات تکثیر HCECs در نظر گرفته شود. · مجله چشم‌پزشکی بینا 1393؛ دوره 19، شماره 3: 233-222.